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            體外多孔肝癌模型的3D生物打。航、評價和抗癌藥物測試

            3D打印動態
            2024
            03/22
            17:25
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            來源:生物設計與制造

            傳統的腫瘤模型往往不能準確地模擬體外腫瘤生長或實現個性化治療,特別是無法發現更有益的靶向藥物。為了解決這個問題,本研究描述了利用三維(3D)生物打印技術,通過將甲基丙烯酸明膠(GelMA)和聚環氧乙烷(PEO)作為兩種不混溶的材料作為生物墨水,并創新地應用熒光碳量子點對細胞進行長期跟蹤,構建了人肝癌SMMC-7721細胞體外腫瘤模型(3DP- 7721)。體積比為3:1的GelMA(10%,質量分數)和PEO(1.6%,質量分數)水凝膠具有明顯的成孔特性,令人滿意的力學性能和生物相容性,可用于創建3DP -7721模型。采用免疫熒光法和定量實時熒光聚合酶鏈反應(PCR)評價模型的生物學特性。與二維培養細胞模型(2D-7721)和三維混合培養細胞模型(3DM-7721)相比,3DP -7721模型顯著提高了細胞的增殖能力以及腫瘤相關蛋白和基因的表達。此外,我們評估了三種培養模型之間的差異以及三種模型中抗腫瘤藥物的有效性,發現三種模型之間的抗腫瘤藥物的有效性存在差異,這是因為三種模型之間的耐藥蛋白和基因存在顯著差異。此外,比較三種模型的成瘤情況發現,3DP -7721模型培養的細胞對裸鼠具有較強的致瘤性。免疫組化評價實體瘤形成相關生化指標水平顯示,3DP -7721模型組表現出惡性腫瘤病理特征,生成的實體瘤與實際腫瘤相似,惡化程度更高。本研究為3DP -7721模型在藥物開發研究中的應用奠定了基礎。

            圖1 實驗過程及檢測流程圖。(a) 生物墨水組成、3D打印工藝和結構交聯示意圖;(b) 建立2D-7721、3DM-7721和3DP -7721模型進行耐藥評價的比較。SMMC-7721:人肝癌細胞;3D:三維;2D-7721:二維培養模型;3DM-7721:3D混合培養模型;3DP -7721:3D生物打印模型;GelMA:甲基丙烯酸明膠;PEO:聚環氧乙烷;CDs:碳量子點

            圖2 GelMA體積比 (10%,質量分數) 與PEO體積比 (1.6%,質量分數) 對孔隙大小有不同的影響。(a-e) 不同GelMA與PEO體積比下羅丹明b染色多孔水凝膠結構的熒光顯微圖和(f-i) 粒徑分布直方圖。GelMA:甲基丙烯酸明膠;PEO:聚環氧乙烷

            圖3 多孔水凝膠結構的 (a) 應力-應變曲線和 (b) 楊氏模量。不同體積比下GelMA和PEO的溶脹率和孔隙率。數據以均數±標準差表示,n=3.*p<0.05, **p<0.01, **p<0.001。GelMA:甲基丙烯酸明膠;PEO:聚環氧乙烷
            圖4 打印參數優化。不同打印速度和壓力(1 bar = 100 kpa)下的打印全景圖。比例尺:3 mm, n=5

            圖5 3D生物打印肝癌細胞模型中肝臟相關蛋白的表達。圖中為3DP -7721模型打印7 d后AFP、Ki67、CYP3A4、ALB的表達情況。比例尺:300 μm。n = 3。3D:三維;ALB:白蛋白;AFP:甲胎蛋白;Ki67:增殖標記蛋白Ki-67;CYP3A4:細胞色素p450氧化酶家族成員;3DP -7721:3D生物打印模型;DAPI:4,6 -二氨基-2-苯基吲哚;CDs:碳量子點

            圖6 生物3D打印肝癌細胞模型中mRNA的表達。第1、5、10、15天2D-7721、3DM-7721和3DP -7721模型中腫瘤相關蛋白和基因的mRNA表達,包括(a) AFP、(b) TGF-β、(c) EpCAM、(d) CD133、(e) IL-8和 (f) CD24。數據以均數±標準差表示,n=3。0.05, **p<0.01, **p<0.001。3D:三維;2D-7721:二維培養模型;3DM-7721:3D混合培養模型;3DP -7721:3D生物打印模型;AFP:甲胎蛋白;TGF- β:轉化生長因子;EpCAM:上皮細胞粘附分子;CD133:prominin-1;IL-8:白介素-8;CD24:分化簇24

            圖7 (a) 3DP -7721模型中SMMC-7721細胞與不同濃度DOX孵育24 h的熒光成像。比標條:300 μm。(b) DOX、(c) 木犀草素、(d) 順鉑在2D-7721、3DM-7721、3DP -7721模型治療48 h后的劑量效應曲線。數據以均數±標準差表示,n=4。SMMC-7721:人肝癌;CDs:碳量子點;DOX:鹽酸阿霉素;2D-7721:二維培養模型;3DM-7721:三維混合培養模型;3DP -7721:3D生物打印模型;IC50:最大抑制濃度的一半

            圖8 2D- 7721、3DM-7721和3DP -7721模型耐藥蛋白和耐藥基因mRNA表達情況。(a) MRP1, (b) BCRP, (c) MDR-1, (d) MRP2, (e) ABCB1, (f) EGFR mRNA表達。數據以均數±標準差表示,n=3。*P<0.05, **p<0.01, **p<0.001。2D-7721:二維培養模型;3DM-7721:三維混合培養模型;3DP-7721:3D生物打印模型;MRP1:多藥耐藥相關蛋白1;BCRP:乳腺癌耐藥蛋白;MDR-1:多藥耐藥1;MRP2:多藥耐藥相關蛋白2;ABCB1:atp結合盒亞家族b成員1基因;EGFR:表皮生長因子受體

            圖9 不同模型細胞的致瘤性。裸鼠 (b) 腫瘤(2D-7721、3DM-7721和3DP -7721培養組)形成腫瘤后21天的照片。(c) 第21天腫瘤重量。數據以均數±標準差表示,n=3。*p<0.05。(d) 不同模型各時間點小鼠體重和 (e) 腫瘤體積。(f) 不同模型實體瘤HE、Ki67、EpCAM、CD133、TUNEL染色結果。2D-7721:二維培養模型;3DM-7721:三維混合培養模型;3DP -7721:3D生物打印模型;HE:蘇木精和伊紅;Ki67:增殖標記蛋白Ki-67;EpCAM:上皮細胞粘附分子;CD133:prominin-1;TUNEL:末端脫氧核苷酸轉移介導dutp -生物素缺口末端標記試驗


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