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            新型3D打印快速DNA分離微流控磁平臺

            3D打印動態
            2024
            02/21
            09:43
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            轉自analytical.chemistry

            生物樣品的純化或分離,特別是作為生物信息存儲分子的脫氧核糖核酸(DNA),是許多遺傳學研究、法醫學、罕見病臨床診斷、癌癥診斷和/或病毒疾病的關鍵和起點。到目前為止,許多不同的技術,如粒徑排除色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法、堿性萃取法、鹽析法、濾紙、硅膠基質(凝膠、樹脂或微球)、磁性珠(市面上有填料柱、重力柱、自旋柱、自旋板和磁支架)等,都已被方便地用于分離DNA。


            相較于傳統的方法,微流體系統提供小型化的實驗室規模的應用,允許在幾微米甚至納米的操作,實現更好的準確性,減少分析時間,并提高整個隔離過程的可靠性,同時最大限度地減少交叉污染的風險。在微尺度上精確控制流體的能力為用連續流動過程和微流體系統中的各種功能組件(如通道、閥門、泵、混合器和傳感器)取代批頂設備開辟了許多可能性。

            在這項研究中,我們提出了一種新的磁性平臺,作為在螺旋微流控裝置中操縱超順磁珠快速分離DNA的創新解決方案。建立了一個計算模型來評估永磁體在平臺上的定位和旋轉。

            研究內容
            將超順磁性二氧化硅微顆粒(1mg)加載到基于pdm的微流控芯片中(圖1D)。將負載顆粒的微流控芯片放置在磁性平臺上(圖1A)。磁場是由微流控芯片下的磁體旋轉產生的。注射器泵以所需的流速(5−20 μL/min)將緩沖液送入微流控裝置。每次實驗開始時,用含有6 M Gu-HCl的結合介質1 × TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA)緩沖液(pH 6.0)以20 μL/min的速度洗滌2 min,制備分離體系。DNA分離主要通過三個步驟進行:(i)吸附,(ii)洗滌和(iii)洗脫。

            圖1  (A) CAD模型及3D打印平臺,(B)平臺的CAD分解圖,(C)用于PDMS成型的金屬模具,(D)微流控芯片(硬幣直徑26.15 mm)。

            在15,000、30,000和80,000倍的5、2和1 μm bars的SEM圖像中,磁性二氧化硅顆粒在形貌上分別為球形和單分散,約為6 μm(圖2B)。表面化學成分包含O、Si和Fe原子,其重量分別為51.03、33.02和15.95%(圖2B)。FTIR光譜顯示了磁性硅珠的化學結構如圖2C所示。1060 cm−1處的峰代表結構中的Si−O−Si鍵。630,570和440 cm−1處的吸收帶屬于鐵納米粒子(Fe−O拉伸)。6通過VSM分析獲得的磁滯曲線(圖2D)來評估顆粒的磁性。磁滯曲線呈現超順磁特征,磁飽和度約為10 emu/g。此外,氧化鐵納米粒子(SPION)包覆的二氧化硅微粒子對矯頑力沒有永久磁化。

            圖2  (A)合成磁性顆粒的形態結構(SEM圖像),(B)表面化學(EDX結果),(C)化學結構(FTIR光譜),(D)磁性能(VSM結果)。

            采用兩種不同類型的DNA作為模型DNA:魚精子DNA和不同濃度的人胎盤DNA進行微流控DNA分離。首先用魚精子DNA進行分離,每步的流速為10 μL/min。分離在30分鐘內完成(吸附10分鐘,洗滌8分鐘,洗脫10分鐘,更換注射器約1分鐘)。在pH為6.0的結合緩沖液中,魚精子DNA被吸附到顆粒上。如圖3A所示,魚精子DNA吸附量隨著DNA負載量的增加而增加。在一定數量的DNA后,吸附劑(磁性二氧化硅顆粒)達到飽和點,不再吸附吸附劑分子(DNA),從而達到最大吸附容量(qm)。吸附效率曲線顯示,實驗qm約為100 μg/mg顆粒(圖3A)。Sips吸附模型也被用于理解吸附過程的行為。Sips模型對魚精子DNA吸附的回歸系數(R2)為0.990。模型的qm值為121 μg/mg。吸附等溫線模型表明,該體系可能以化學吸附為主,可以認為是一個單層吸附過程。利用人胎盤DNA研究了在相同條件下(每步流速為10 μL/min,結合緩沖液pH為6.0)系統的吸附行為。選擇較高的濃度來確定不消耗DNA樣品的最大吸附量(圖3B)。實驗發現qm約為110 μg/mg,這與文獻中幾種批處理系統中使用的磁性納米顆粒(16−121 μg/mg)相當。Sips模型擬合實驗數據點,回歸系數為0.998,qm為109 μg/mg,與實驗數據吻合良好。采用不同pH值的1 × TE緩沖液測定其解吸效率。以10 μL/min和100 μL洗脫量的魚精子DNA在室溫下重復實驗3次(圖3C)。

            結果表明,化學相互作用在解吸過程中也起主導作用。隨著洗脫緩沖液pH值從7.0增加到9.0,解吸效率也從18%增加到38%。

            圖3  (A)魚精子DNA和(B)人胎盤DNA的吸附量。在每種流速下(樣品流速為10 μL/min),三次獨立重復實驗的平均值均為±標準誤差。(C)不同ph值下魚精子DNA的解吸效率。每個pH值下3次重復實驗(樣品流速為10 μL/min)。

            以魚精子DNA為模型DNA,結合緩沖液pH為6.0,洗脫緩沖液pH為8.0,研究了流速對分離步驟的影響,比較了類似材料和分離DNA所用的方法。為此,分別以5、10、20 μL/min的流速進行3次重復實驗。由圖4可知,吸附效率與流速成反比,在10 μL/min的流速下,吸附性能在70%左右達到飽和。在達到飽和后,磁性顆粒不再具有結合額外DNA的能力,這導致吸附效率達到平臺期。隨著流速的降低,DNA緩沖液在微通道內的停留時間會增加,從而影響顆粒表面與DNA分子的接觸時間,從而影響吸附動力學和靜電相互作用,從而提高DNA吸附。此外,微粒上的阻力也減小了,這使得DNA分子更容易附著在微粒上。對解吸性能進行評價時,可以明顯看出,解吸效率隨著流量的增加而增加,當流量為20 μL/min時,解吸效率可達75%左右。這可以歸因于作用在DNA分子上的阻力的增強,這有助于從顆粒表面分離。

            在模擬中,重離子垂直入射,MCD-FET和CAVET最敏感的位置都在p基右側,圖9中灰色箭頭所示,p基附近存在高電場區?紤]到最壞的情況,重離子會穿透整個裝置。圖4顯示了MCD-FET和CAVET在關斷狀態(VDS = 100 V, VGS = 0 V)下的IDS隨時間的變化。MCD-FET和CAVET的IDS均上升到當前峰值(Ipeak),隨后逐漸降低。與CAVET相比,MCD-FET表現出10.11 mA的低峰,降低了64.9%。

            圖4  不同流速下平臺對魚類精子DNA的吸附、解吸和分離效率。這些值是在每個流量下三次獨立重復實驗的平均值,±標準誤差。

            為了快速分離DNA,總操作時間必須保持在最低限度。吸附效率在5 μL/min時最佳,解吸效率在20 μL/min時最佳。10 μL/min時的吸附效率也接近5 μL/min時的吸附效率。在較短處理時間的最佳操作條件下,吸附步長為10 μL/min,洗滌和解吸步長為20 μL/min,操作時間為10 min(吸附5 min,洗滌2 min,洗脫3 min),分離效率可達50%以上。

            表1給出了我們的平臺與文獻中可用的其他技術的不同方面的比較。

            表1  文獻中不同DNA分離方法的比較
            雖然有比我們平臺的分離效率更高的方法,但考慮到樣品的數量、裝載樣品的數量和處理時間,我們的平臺具有更高的性能。但仍有改進的空間,特別是在解吸過程中。在文獻中,有研究通過將洗脫緩沖液中的鹽量增加到1m,并在高溫下使用磷酸鹽緩沖液來提高解吸效率。因此,我們的平臺的解吸性能可以進一步提高,這將提高分離效率。此外,我們的螺旋微通道內有40 μL的體積,這影響了加工時間。微通道的體積、通道尺寸和流速可以進行優化,以進一步縮短處理時間,從而確?焖俑綦x。我們的平臺設計非常靈活,實際上,微通道的幾何形狀可以根據要處理的樣品數量進行優化。

            總結與展望
            在這項研究中,提出了一種新型的小型化裝置作為3D打印的微流控磁平臺,用于快速分離DNA。這種新穎的設計使磁性顆粒在螺旋微通道的限制下連續流動。開發了一個計算模型來評估磁操縱粒子的有效性。

            內部合成的超順磁單分散二氧化硅顆粒用于分離魚精子和胎盤DNA。通過全面的實驗評估了平臺的吸附、解吸和隔離效率。我們的實驗表明,在我們的平臺上,DNA分離可以在10分鐘內完成。

            最近,我們的團隊開發了柔性液壓儲層(FHR),用于樣品加載到微流控芯片中。帶有集成閥門的新版本FHR正在開發中。隨著新版本FHR的實施,在手術過程中不需要更換注射器,這最終將使整個過程完全自動化。此外,我們的平臺具有靈活的設計,可以根據特定應用修改FHR和微通道的體積。

            因此,考慮到樣品數量的靈活設計,快速分析,依賴于相對不太復雜的設備,低成本制造,以及最重要的是,具有便攜式護理點測試的潛力等優秀特性,我們的平臺是低成本,快速DNA分離的可行選擇。進一步提高分離效率和應用我們的平臺分離不同的生物材料,如細菌、病毒、外泌體等,將是我們未來的一些研究方向。

            論文信息:Gnes Kibar, Buigra Sartarslan, Serkan Doganay, Gokay Yildiz, O. Berk Usta, and Barbaros Cetin.
            論文鏈接:https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c04412


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